产品目录

构建新的重组DNA分子通常是用合适的限制性内切酶酶切和连接来进行.当目标片段的粘末端与新的载体的粘末端是相同或互补，那么亚克隆将就很简单。然而在很多实验中，目标片段的末端与载体是不相互补的。经常需要将片段补平后再与其它的平端载体相连。本试剂盒的原理是利用大肠杆菌DNA多聚酶I的Klenow片段多聚酶活性能够补平不互补的5’端突出端为基础的。对于用2个不同限制性内切酶酶切所获得的片段，可以选择性补平一端。先用限制性酶#1切开DNA，然后用Klenow片段补平末端，再用75℃加热10分钟灭活，最后用限制性酶#2酶切。如果2种限制性酶的缓冲液是相容的，限制性酶#2的反应就可以在同一种缓冲液中进行。

T4 DNA连接酶可以对平端和粘端DNA进行有效的连接。用此试剂盒可在短时间完成（1小时）连接反应。

• 样品DNA：用BAP或CIAP除去线性DNA的5’末端的磷酸基团，可以有效减少DNA的环化现象。
  
• 根据线性DNA末端浓度推算方法计算样品DNA浓度。公式如下
  p mol ends=p mol DNA×[(number of cuts×2)+2]
  
• 在连接反应体系中，插入DNA与载体DNA的浓度比率在1～3之间，可获得相当数量重组体DNA。
  
• 在连接缓冲液中加入PEG提高平端DNA的连接速率。连接过程中载体DNA可自环化，片段会连成寡聚体。优化插入片段和载体末端浓度和比率有利于提高正确连接产物的产率。

• 在1.5mL无菌干净的离心管中配制下列连接体系：
  

  成分	用量
  10×Klenow Reaction Buffer	2μL
  dNTP Mix	2μL
  样品DNA	50ng/5μL
  Klenow DNA Polymerase	1μL
  Sterilized ddH2O	至30μL

  
  
  • 一般最后加入Klenow DNA Polymerase。
• 在离心机上微离3-5 s，37℃孵育10min。
  
  • 使混合物聚集在离心管底部。
• 75℃孵育10min。
  
  • 终止反应。
• 在离心管中依次加入下列溶液。
  

  成分	用量
  平端载体DNA	3μL
  10×Ligation Buffer	5μL
  PEG4000 Solution	10μL
  T4 DNA Ligase	2μL
  上述反应液	30μL
  Sterilized ddH2O	至100μL

  
  
  • 一般最后加入T4 DNA Ligase。
    
  • PEG可提高平末端DNA的连接速率。
    
  • 连接反应体系中，插入DNA与载体DNA的浓度比率在1～3之间，可获得相当数量重组体DNA。
• 在离心机上微离3-5 s，22℃孵育1h。
  
  • 使混合物聚集在离心管底部。
• 将混合物用于转化，重组的克隆可通过蓝白筛选。